Kısıtlama enzimleri, hem tek hem de çift sarmallı DNA'yı kesen enzimlerdir. Her kısıtlama enzimi, tanıdığı ve kestiği bir kısıtlama alanı adı verilen özel bir nükleotit sekansına sahiptir. Kısıtlama enzimleri, DNA dizilimi, mutasyon analizi ve DNA'nın klonlanması ve büyütülmesi için kullanılır. Bilim adamları, ifade genlerine, kromozomal DNA'dan ayrı olarak kopyalanabilen DNA molekülleri olan ekspresyon vektörlerine eklemek için kısıtlama enzimleri kullanırlar. İlgili geni içeren vektör daha sonra proteinlerin ekspresyonu ve karakterizasyonu için bir bakteri suşuna sokulabilir.
Vektörünüzdeki bir kısıtlama haritasına bakarak kısıtlama enzimi alanlarını tanımlayın. Sınırlama haritası size hangi enzimlerin vektörünüzü kestiğini ve nerede keseceğini söyleyecektir.
Ayrıca, gen eklentinizde bulunan bir siteye sahip olan bir kısıtlama enzimini seçin; yerleştirin. Kısıtlama sitesinin insertinizde ilgi geni dışında bir konumda olduğundan emin olun, bu nedenle genin hiçbir bölümünü kaybetmezsiniz.
Hiçbir kopyasının olmadığından emin olun. gen ekleme veya vektörünüzün herhangi bir yerinde kısıtlama sitesi. Bu, DNA'nızda çoklu kesilmelere neden olur ve yanıltıcı veriler sağlar.
Künt uçlar yerine yapışkan uçlarla kesen kısıtlama enzimlerini seçmeye çalışın. Yapışkan uçlar, enzim çift sarmallı DNA'yı kademeli bir şekilde kesip, ters yönde kesilmiş bir uçla tutturmayı kolaylaştıran tek sarmallı bir çıkıntı bıraktığında meydana gelir. Künt uçlar, çift sarmallı DNA yumuşak bir şekilde kesildiğinde meydana gelir ve bunların takılması daha zordur.
Eklemenizin her iki ucu için farklı bir kısıtlama enzimi seçin. vektöre uygun oryantasyonda yerleştirilir ve vektörün kendisine tekrar bağlanmamasını sağlamak için kullanılır.
Aynı tampon sisteminde ve sıcaklıkta iyi çalışan iki kısıtlama enzimi seçmeye çalışın . Bu mümkün değilse, her sindirimi ayrı ayrı çalıştırın.
İpucu
Bir DNA sekansındaki kısıtlama alanlarını hızlı bir şekilde tanımlamak için bazı web programları geliştirilmiştir. Böyle bir program, New England BioLabs'tan alınmıştır.
Gerekenler
Gen insert dizisi
Seçim vektörü için kısıtlama haritası
Kısıtlama enzimlerinin ve kesim yerlerinin listesi
, , ] ]