Optimum pH: Pepsin ve trypsin katalitik aktiviteleri açısından farklı optimum pH aralıklarına sahiptir. Pepsin, midede bulunan 1,5-2,0 civarındaki optimum pH ile asidik koşullarda en iyi şekilde çalışır. Tripsin ise hafif alkali bir ortamda, ince bağırsağın karakteristik özelliği olan 7,5-8,0 civarındaki optimum pH ile en iyi şekilde çalışır.
Sıcaklık: Pepsin ve trypsin ayrıca maksimum aktivite gösterdikleri farklı sıcaklık aralıklarına sahiptir. Pepsin, mide içindeki sıcaklık olan vücut sıcaklığında (yaklaşık 37 santigrat derece) en aktiftir. Ancak Tripsin, ince bağırsaktaki sıcaklığa karşılık gelen 40-45 santigrat derece gibi biraz daha yüksek sıcaklıklarda en aktiftir.
Yüzey spesifikliği: Pepsin ve trypsin farklı substrat özelliklerine sahiptir, bu da farklı protein türlerini tercihli olarak sindirdikleri anlamına gelir. Pepsin esas olarak midede proteinlerin ilk parçalanmasında rol oynar ve fenilalanin, tirozin ve triptofan gibi aromatik amino asitleri içeren peptit bağlarını parçalamayı tercih eder. Tripsin ise ince bağırsaktaki sindirim süreci boyunca daha fazla çalışır ve lisin ve arginin gibi temel amino asitleri içeren peptid bağlarını parçalama özelliğine sahiptir.
Optimum pH, sıcaklık ve substrat spesifikliğindeki bu farklılıklar, pepsin ve tripsinin sindirim süreci sırasında proteinler üzerinde sıralı ve seçici bir şekilde etki etmesini sağlar. Pepsin, midenin asidik ortamında proteinlerin sindirimini başlatır ve onları daha küçük peptit parçalarına ayırır. Mide içeriği ince bağırsağa doğru ilerledikçe pH daha alkali hale gelir ve trypsin aktif hale gelir. Tripsin ayrıca pepsin ve diğer sindirim enzimleri tarafından üretilen peptit parçalarını parçalar ve sonuçta amino asitlerin kan dolaşımına emilmesine yol açar.