Spektrofotometre kullanılarak trypsin deneyinin son noktasının belirlenmesine yönelik geliştirilmiş bir prosedür aşağıda verilmiştir:
Malzemeler:
- Tripsin çözeltisi
- Kazein substrat çözeltisi
- Sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi (0,1 M)
- Spektrofotometre
- Küvetler
Prosedür:
1. Reaksiyon Karışımını Hazırlayın:
- Bir küvette belirli bir hacimdeki kazein substrat solüsyonunu (örn. 1 mL) uygun hacimdeki trypsin solüsyonuyla (örn. 0,1 mL) karıştırın.
- Karışımı uygun bir sıcaklıkta (örneğin 37°C) istenilen süre boyunca (örneğin birkaç dakika) inkübe edin.
2. Reaksiyonu Durdurun:
- Belirli zaman aralıklarında (örn. her dakika), reaksiyon karışımından küçük bir miktar (örn. 0,1 mL) çekin ve bunu ayrı bir küvete aktarın.
- Reaksiyonu durdurmak için hemen yeterli miktarda sodyum hidroksit çözeltisi (örn. 1 mL) ekleyin.
3. Absorbansı Ölçün:
- Durdurulan her reaksiyon karışımının belirli bir dalga boyunda (örn. 440 nm) absorbansını ölçmek için spektrofotometreyi kullanın.
4. Absorbansın Grafiği:
- Zamanı (x ekseni) ve absorbansı (y ekseni) gösteren bir grafik çizin.
5. Uç Noktayı Belirleyin:
- Zaman içindeki absorbans değerlerini analiz edin. Son nokta, absorbansın bir platoya ulaştığı veya kazeinin yoğun hidrolizini gösteren önemli bir düşüş gösterdiği zaman noktasıdır.
Bu yöntem, kazein hidrolizi sırasında daha küçük peptitlerin ve amino asitlerin salınmasından dolayı absorbanstaki değişikliğin ölçülmesine dayandığından, çözeltinin temizlenmesinin görsel olarak gözlemlenmesine kıyasla daha objektif ve niceliksel bir son nokta belirlemesi sağlar.