Pepsin asidik bir ortamda, özellikle de yaklaşık 1,5 ila 2,0 pH'ta en etkilidir. Bu pH aralığı, hidroklorik asitin varlığından dolayı mide için tipiktir. Bu asidik koşullarda pepsin, katalitik bölgesini aktive eden konformasyonel değişikliklere uğrar ve proteinlerdeki peptit bağlarını verimli bir şekilde parçalamasına olanak tanır.
PH optimal aralığın üzerine çıktıkça pepsinin aktivitesi giderek azalır. Bunun nedeni, yüksek pH'ın enzimin yapısında değişikliklere neden olması, substrata bağlanmanın azalmasına ve katalitik aktivitenin azalmasına yol açmasıdır. PH 4'ün üzerine çıktığında pepsin büyük ölçüde etkisiz hale gelir.
Pepsinin pH'a bağımlılığı, öncelikle midenin asidik ortamında aktif olmasını sağlar. Yiyecek mideye girdiğinde asidik koşullar, protein sindirim sürecini başlatan pepsin salgılanmasını tetikler. Yiyecek ince bağırsağa geçtiğinde pH artar, pepsinin denatürasyonuna ve inaktivasyonuna neden olur ve diğer enzimler sindirim sürecini devralır.
Bu nedenle, pepsinin etkinliği aslında pH'dan etkilenir ve aktivitesi midenin asidik ortamında optimaldir.