Protocols , moleküler klonlama ilk adım , çoğu zaman da DNA parçalarını çoğaltmak için ısıtma ve soğutma döngüleri kullanarak bir polimeraz zincir reaksiyonu (PMR) , içermektedir. Hedef sekans boyutuna ulaşmak için, diğer protokoller DNA sonication , reaksiyon, enzim sindirimi ve kimyasal olarak sentezlenmiş oligonükleotidlerin kullanımı bulunmaktadır. Bu protokoller, gerekli izole edilmiş DNAbüyüklüğü ve miktarına bağlı olarak değişir. Ligasyon için
ligasyon
Protocols ile birlikte, DNA molekülleri katılması için , DNA ligaz , bir enzim kullanılarak içerir kovalent bir bağ . Protokol , bir mikrosantrifüj tüpü içinde DNA fragmanlarıbir klonlama vektörü, bir ligasyon tamponu ,DNA ligaz ve steril suyun bir araya getirilmesiyle ve 4 ° C'de, gece boyunca inkübe belirler.
Transfeksiyonu
Protocols , genellikle doğrudan bir şekilde hücre sitoplazması içine DNA enjekte edilmesini ihtiva eder . Diğer yöntemler , hücre zarı boyunca transfeksiyon kompleksi sunmak için , örneğin kalsiyum fosfat ve lipidler gibi kimyasal reaktif maddeler , kullanmayı içerir. Bu yöntem, spesifik genlerinişleyişi üzerinde gen değiştirmeninetkilerini sınar.
Seçim
Seçimi veya taramanın , protokoller hücreler başarıylaDNA eklemesi düzenlenen belirlemek ve göstermek hücrelerin izolasyonu gerekir ki . Daha sonra , bir lisozim içerisinde inkübe edilir transfekte edilmiş DNA , ( doğal olarak bulunan bir enzim ) içeren bir santrifüj hasat hücreler tampon maddesi ve bir alkalin deterjan ile muamele ,proteinler ve membranlar çözünürlüğe verir. Proteinleri çökeltmek için asetat kullanarak, santrifüj ve tülbentDNA içeren süpernatant ( santrifüj bir bileşikten kalan çözünebilir sıvı) filtre. Süpernatan , polietilen glikol ile çökeltilmiş , santrifüjlenmiş ve bir sezyum klorür ve etidyum bromür tampon maddesi içinde süspansiyon haline getirilir . Etidyum bromür yoğunluğuna göre olan DNA lekeleri ve uzun dalga UV ışık kullanılarak , alt -bant DNA beş cc şırınga ile ekstre edilir. Bir iyon değiştirme sütunu, dengelenmişetidyum bromid ve sesyum klorid gelen DNA ayıran ve son DNA pelet bir tampon madde çözeltisi içinde süspanse edildi ve agaroz jel elektroforezi üzerinde tespit edilir.