Krioprezervasyon uygulamaları metabolik faaliyetlerini askıya son derece soğuk sıcaklıklar kullanılarak süresiz olarak saklanabilir hücreleri izin olanlardır . Denge (konvansiyonel yavaş dondurma ) ve denge dışı ya da ultra - hızlı dondurma ( vitrifikasyon ) : iki ana dondurulması prosedürleri türleri vardır . Terim vitrifikasyonLatince " vitreus " geliyor veya camsı . Her iki prosedür , dondurma işlemi sırasında hasarı önlemek için hücre -tipi antifriz özellikleri olan , dondurarak saklama koruyucuları kullanın. Hücreler donmuş veya vitrifiye sonra, bunlar sıvı azot , -196 ° C ( -321 F) bir sıcaklığa sahip olan bir çok soğuk akışkan içine daldırılarak süresiz olarak saklanabilir . Çözündükten sonra , hücre içinde metabolik aktivite geri getirmek için, toksik kriyoprotektanlarla hücre, normal çalışma sıcaklığına kadar döndürülür yavaş yavaş geri hücre ve normal su dengesinin uzaklaştırılmalıdır .
Cell- Belirli faktörler
hücreler veya doku dondurularak saklanabilmesi için kullanılan prosedür , hücrenin boyutu da dahil olmak üzere bir dizi faktöre bağlıdır , hücre sıvısı ( sitoplazma ) miktarı ve hücre (tek hücre ya da karmaşıklığı doku) . Yumurta gibi sitoplazma büyük bir miktarı ile hücreler sperm hücreleri gibi sadece artık sitoplazma , hücrelerden daha dondurularak saklanabilmesi, daha zordur. Farklı boyutlarda , en az üç farklı hücre tipleri yumurtalık dokusu , farklı optimal donma ihtiyaçları olan her birinde mevcut olduğu için yumurtalık dokusu dondurma işlemi daha zordur. Yavaş dondurma protokolleri , çeşitli hücre tipleri ile başarı ile kullanılmaktadır . Vitrifikasyon anda tek hücreli dondurma ve dokuları ile daha az etkili olan en etkili olduğu , ancak araştırma dokuların vitrifıkasyonuna optimize devam etmektedir . Kriyoprotektanların
Rolü
Sitoplazma bir hücre donma sıcaklığında buz kristalleri döner su içerir. Bir hücrenin içinde zaman buz formları ,hücre parçalanmış ve ölür . Bu nedenle, hücre içindeki sıvı önceki hücre hasarı önlemek için , donma sıcaklıklarına ulaşmak için kaldırılması gerekmektedir. Antifriz ( kriyo-koruma ) sıvıların çeşitli tipleri propandiol, dimetil sulfoxde (DMSO), etanol ve sukroz ve trehaloz gibi şekerler, gliserol de dahil olmak üzere , dondurma işleminden öncehücre kurutmak için kullanılabilir . En uygun soğutma hızı (ve eritme ) kullanılan dondurarak saklama koruyucusunun tipine ve (ya da bu olarak) dondurulacak olan hücre veya doku özelliklerine bağlıdır. Kriyokoruyucular, sıcak metabolik sıcaklıklarda , dondurarak saklama koruyucuları ile , hücre riski en aza indirilir veya kaçınılması gereken çok hücreleri metabolize için toksiktir. Metabolik aktivite restore önce çözüldükten veyahücreleri ısınma üzerine kriyoprotektanlarla tamamenhücreden çıkarılması gerekir .
Denge Dışı Denge Krioprezervasyon Usulü
donmahızı Karşı donma protokol denge - veya non - dengeden tabanlı olmasına bağlıdır . Hücre su susuz edildiği de oranı ve hücre dışında suyun buz aşamasına transforme edildiği de oranı arasında bir denge olduğu zaman denge tip işlemler için, en uygun donma oranı elde edilmiştir. Bu denge ya da yavaş dondurma protokolleri genellikle tamamlamak için saat sürebilir ve bir bilgisayardonma oranları gerekli tam olarak emin olmak için programlanabilir bir oran dondurucu çalıştırmak için kullanılır . Bir " hold " tipik var manuel marş buz kristallerinin oluşmasını veya "tohumlama " izin vermek içinbaşlangıç yakınprotokolünde adım hücrelerin dışındasıvısında .
vitrifikasyon , rampalarda güveniyor ve dehidratasyon ve buz kristali oluşumu arasında bir denge elde değil donma tamamen farklı bir yaklaşım kullanılmaktadır . Vitrifikasyon buz oluşumu ve hücresel sıvı hücreye zarar vermeden , bir cam ya da cam fazına direkt olarak dönüştürülür için zaman yetersiz olduğu kadar ultra - hızlıdır. Hücre doğrudan anlık camsı devlet ulaşma , son derece soğuk sıvı azot içine daldı çünkü Programlanabilir oranı dondurucular gerekli değildir .
Slow - Freeze Prosedür
ilk adım yavaş dondurma prosedürü su serbest yavaşçadondurarak saklama koruyucusunun ile hücrenin dengelenmesini sağlamak için kademeli bir kademeli bir şekilde dondurarak saklama koruyucusunun için hücreyi ortaya koymaktır. Hücreler, hücre suyun çoğunluğunun temizlendikten sonra,dondurarak saklama sıvısındahücreleri, saman , plastik , cam ya da ampul için hücreleri çevreleyen sıvının plastik vial.The hacim olarak , bir tür bir kap içine yerleştirilir yavaş dondurma , bir çay kaşığı daha genellikle küçüktür ve sadece bir kaç damla olabilir . Önceden etiketlenmiş kap , doldurulmuş ve kapatılmış birkaç dakika veya saat yavaş yavaş çok düşük sıcaklıklara kadar bir süre boyunca , kabın sıcaklık azalır programlanabilir bir derin dondurucu, konur. Soğutma bir kaç dakika sonra, başlangıç buz kristalleri " tohumlama " ile , kabın içindeki oluşturulmalıdır kap . Tohumkabı dokunun ve buz kristal oluşumuna neden olmak için , sıvı nitrojen içinde önceden soğutulmuş olan bir araç (örneğin, forseps ) kullanılarak gerçekleştirilir. Bu marş kristal güvenle uzakhücreleri , tek bir noktada kontrollü buz kristali oluşumunu başlatacak . Tohumlama tamamlandıktan sonra, soğutma rampaların kalan devam edebilir . Kap -30 ve -85 ° C arasında sıcaklığa ulaştığında, hücreleri tutan kap, -196 ° C
Vitrifikasyonu
soğutulduktan tamamlamak için doğrudan sıvı azot içine daldırıldı edilebilir örneğin vitrifikasyon
Ultra hızlı denge dışı soğutma prosedürleri doğrudan sıvı azot içine daldırma ile elde hücreleri neredeyse anlık dondurma oranı , dondurarak saklama koruyucuları ile birlikte yüksek konsantrasyonlarda kullanımı . Vitrifikasyon buz kristali oluşumu faz atlar ve doğrudan cam benzeri bir faz içine su taşır. Vitrifikasyon 10C/min veya daha karşılaştırıldığında , yavaş dondurma ile aynı son nokta sağlar , ancak -3000C/min bir oranda . Vitrifikasyon için, hücreler , genellikle hücre önce sıvı azot içine dalan yüzey gerilimi ile kabın tutunur , böylece yeterli bırakarak, saman ve fazla krio-koruyucu kaldırılır ucuna yerleştirilir. Dondurma çok hızlı olduğu için, dondurarak saklama koruyucuları maruz kalma süresi daha az olan , ve , dondurarak saklama koruyucuları çok daha yüksek konsantrasyonları, hücre tarafından tolere edilebilir. Normal metabolik işleyişi geri döndürmek içinhücrenin Isınma ayrıca inanılmaz derecede hızlı olmalıdır . Sıvı azot yukarıdaki bir sıcaklığa daha kısa bir kalma plansız bir ısıtma işlemi ve hücre için zararlı olan tekrar soğutulmasından , başlayabilir , çünkü vitrifiye örneklerin ele alınması uzun dondurulmuş numuneler çok daha titiz olup .