ligasyonu ve dönüşüm dahil adımların bir listesini formüle dönüşüm giderme
Deiyonize su
. Herhangi bir bilimsel protokol giderme genel olarak geriye doğru ,son aşamada başlar.
2P , kit ile birlikte verilen kontrol DNA için örnek saflaştırılmış DNA ürünü karşılaştır . DNA ve dönüştürülmüş bakteriler içerisinde klonlanmıştır sonra, izole edilmiş, saflaştırılmış ve agaroz jel elektroforezi ile kontrol edilebilir. Elektroforez içinsonuçlar dönüşüm başarılı olup olmadığını belirtmek istiyorum.
3
klonlama sırasında bakteri üremesini belirleyin . En çok bakteriyel vektörler bir DNA parçası ile çok yalnızca inşa edilir - ampisilin ya da başka bir antibiyotik ihtiva eden bir ortam üzerinde büyüyecektir. Zayıf büyümeDNA örneği başarıylavektör içine takılı olmadığı kurmak olabilir .
4.
lige DNA örneği öncesinde dönüşüm , arıtılmış olduğunu onaylayın . Tampon tuzları ve ligasyon enzimler , sokulan DNA'nın dönüşümünü inhibe edebilir. Bu ligasyon enzim ligasyon işleminin tamamlanmasından sonra, ısı ile inaktive edilmiş olduğunu tespit etmek de önemlidir . Aktif ligaz potansiyel dönüşümü ile müdahale edebilir .
5
dönüşümü için kullanılan bakteriyel stoku üzerinetarihini kontrol edin. Alt bakteri hücrelerinin zaman içinde verimliliği gevşek. En sonunda bakteri hücreleri dönüşüm ve kalite klonlama mümkün değildir. Dönüşümsüreci teşhis edildikten sonra,ligasyon prosedürü analiz başlayabilir .
Sorun ligasyon
6
ligasyon öncesinde , DNA örneğinin saflığını onaylayın . DNA örneğinde Salt kirletici zayıf ligasyon neden olabilir. Bu ligasyon kullanılan önce DNA örneği , saflaştırılmış ve bunların tuzları ve enzimlerin arındırılmış olmalıdır .
7
lige edilmesi için DNA iplikçikleri uçları kör veya yapışkan olup olmadığını kontrol edin. Ligasyon belirlenen sınırlama enzimleri ile sindirme sonrasında, küt uçlar veya yapışkan uçları olan ayrı ayrı şeritlerin bağlamak için kullanılır. T4 DNA ligaz kör uç DNA için tercih edilen bir enzim olan - ama aynı zamanda yapışkan uçları olan DNA için çalışacaktır. Diğer DNA ligaz tek bir sınırlandırma yapışkan uçlar yaratmak üzere sindirimi takiben, DNA için çalışabilir. Bu testiçin uygun DNA ligazı kullanmak önemlidir .
8
bağlanmasından önce DNA örneklerinin kontrol konsantrasyonu. Yüksek konsantrasyon ile kullanılması genellikle doğrusal bir DNA olmak için DNA neden olur. Kit talimatlar ligasyon reaksiyonunda kullanılacak DNAdoğru miktarı hakkında bilgi verecektir .
9
yeni bir parti ile ligaz enzimini değiştirin . Enzimler , oda sıcaklığında ve devam eden dondurma-çözme döngüsü özellikle duyarlıdır. Ligaz sadece çok kez dondurma ve çözülme kullanan bir dizi , takip zarar görebilir . Bazı kitleri ligaz yeniden dondurulur sayısını azaltmak için , ilk kullanım sırasında küçük porsiyonlar halinde bölünerek öneririz .
10ligasyon kiti kontrol
. Genellikle ligasyonu ilesorun süresi doldu veya diğer DNA ve tuzları ile kirlenmiş olan bir kiti kullanıyor .