Hasat hücreleri göster . 1 ml , altı oyuklu doku kültür plakasının bir kuyusundan hücreleri toplamak için yeterlidir. Hücreler iyice homojenize ve ardındanTrizol veri sayfasında açıklandığı gibiçıkarma prosedürünü yürütmek için yukarı ve aşağı pipetle vardır . Kısaca , kloroform ile DNA , protein ve RNA fazları ayırmak için daha sonra santrifüj ekstrakte edin. Sadecerenksiz RNA fazı kurtarmak ve izopropanol ile bu çöktürmek . İnkübasyondan sonra, bu santrifüjler ve çeşitli etanol yıkama ile elde edilen pelet temizlemek. Daha sonra RNase - içermeyen su içinde pelletini. Ters transkripsiyon
2P , RNaz içermeyen su , 10 mikrolitre ( ul ) hacim olarak 65 santigrat derece RNA, tam olarak 5 mikrogram denatüre , sonra hızlı bir şekilde buz üzerine yerleştirin . Her bir reaksiyon için, RNA , 10 ul 10X PCR reaksiyon tamponu 3 ul , 10 milimolar dNTP 2.5 ul , 25 milimolar magnezyum klorür 6 l , mililitre konsantrasyon başına 1.8 miligram arasında rasgele primerlerin 1 ul ve üst simge 0.5 ul kombine II transkriptaz enzim ters . RNaz ücretsiz su 17 ul her reaksiyonu kontör . On dakika süre ile oda sıcaklığındainkübe edin ve daha sonra cDNA üretmek için bir saat boyunca 42 santigrat derece , daha sonra reaksiyonu durdurmak için 95 ° C'a ve hızlı bir şekilde buz bozunurlar .
3
bir polimeraz zincir reaksiyonu için, yine de , ters transkripsiyon reaksiyonu , 10X PCR reaksiyon tamponu , 1.5 ul Taq polimeraz , 0.2 mikrolitre , ters primer , 0.5 mikrolitre yapılan cDNA 6 ul birleştirerek ve 0.5 ml tüpler içinde , bir reaksiyon karışımı kurmak ileri astar , daha sonra RNaz içermeyen su 10.3 ul her tüp kontör . Son tavlama için 45 saniye boyunca 60 santigrat derece ve ardından denatüre etmek için 0.5 dakika boyunca 95 ° C, ve 72 derece : a termal döngü aşağıdaki gibi 30 döngü boyunca (yani bir polimeraz zincir reaksiyonları gerçekleştiren bir makine) kurmakreaksiyonları , çalıştırmak için sentezlenen transkript uzatmak için 1 dakika boyunca Celsius .