Hücreler büyüme ortamı 100 mikro litre ve hücreler bir gece boyunca çökelmeye bırakılır , 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına yerleştirilmelidir. Bir faktörhücrelerin tepki eğitim konum hücreler, serumsuz 24 saat ve daha sonra çalışma altındaki faktörü ile uyarılan olmalıdır.
Sabitleme ve birincil antikor
ortamın çıkarılmasından sonrahücreler, 3 yüzde formaldehid , ya da metanol gibi bir sabitleyici ile işleme tabi tutulur. Hücre zarı antikor, hücre nüfuz etmesine izin vermek için geçirgen olması gerekmektedir. Metanol daha önce kullanılan edilmemiş ise Permeabilization , yüzde 0.1 Triton kullanılmasıyla elde edilebilir. Spesifik olmayan bağlanma , fosfat tamponlu tuzlu su içinde seyreltildi yüzde 10 fetal buzağı serumu kullanılması ile önlenebilir . Bloğunun çıkarılmasından sonra primer antikor uygulandığında ve bir saat süre ile kuluçkalanmıştır .
Ikincil antikor ve Leke
birincil antikorunu çıkarın ve yıkama edilebilir üç kez . Örneğin bayır turpu peroksidazı gibi bir algılama maddesi ile bağlantılı ikinci bir antikor ekleyin . Bir saat süreyle inkübe edin. Wash kimyasal parlak substrat solüsyonu ekleyin . Geliştirmek ve renk yoğunluğu içinplaka tarama .