soğuk fosfat ile çalışmanın altındahücreleri veya doku yıkayın göster
tamponlu tuzlu su, PBS . 10 dakika için oda sıcaklığında ve daha sonra 20 dakika boyunca kuru buz karışımı yerleştirerek ve hücreleri ayıklamak ya da ekstraksiyon tamponu içinde doku parçalamak . Tekrarlayın .
2
Vortex 10 saniye boyunca . Hücre veya doku yıkıntıları pelet haline getirildi , 5 dakika için bir santrifüj içinde dönerler. Süpernatant ,sıvı faz çıkarın ve temiz bir tüp içindesıvı yerleştirin .
3
enzimleri olacak arıza NADH .
4 kaldırmak için özel bir filtre aracılığıyla süpernatantı Filtresi
NAD denatüre etmek için 30 dakika için bir ısıtma bloğu içinde 60 santigrat derece temiz bir tüpe ve ısı 200 mikro litre , yer çıkarın . Serin ve santrifüj ve kaldırmak sıvı faz . 96 oyuklu bir plaka içerisine aktarınız 50 mikro litre ; Her bir numune , iki veya üç kez olmalıdır. Toplam NADH'ye belirlemek için , NADt , 5
. Isı hazırlayın ve96 plaka için bisiklet karışımı eklemek gerekmez. Karıştırın ve 5 dakika boyunca inkübe edin. Geliştirici 10 mikro litre kadar ilave edin ve 4 saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya bırakın. Durdurma çözüm ekleyin . Kiti bağlı bir plaka okuyucu veya florimetrede renk değişikliğini okuyun .
Standart Eğri ve Hesaplama
6
NADH'ın bilinen bir konsantrasyon alıp sulandırarak bir standart eğri hazırlayın ekstraksiyon tamponu içinde . Son hacim sağlamak test numuneleri olarak aynı kalır , farklı konsantrasyonlarda içine seyreltin. Test örnekleri ile aynı 96 -yuvalı plaka üzerinde Plate. Optik yoğunluk okuyun.
7.
X ekseni veY ekseni üzerinde optik yoğunluğuna konsantrasyon ile standart eğri grafiği çizin . Her bir test numunesinin ortalamasını alın ve standart eğri grafiği arasındaki konsantrasyon okuyun.
8
NADH gelen toplam NAD , NADt çıkarılmasıyla ve daha sonra bölünerek NADHNAD /NADH oranını hesaplayın.