üzerindebisiklet tamponunu ayarla
göster
Mikro santrifüj
Eppendorf tüplerine
Kuru buzu ihtiyacınız olacak şeyler bir sayaç ve tampon oda sıcaklığına ulaşmasına izin verir. Tampon içinideal sıcaklık 22 derecedir .
2
bisiklet tampon tam 220 mikrolitreNAD bisiklet enzim karışımı sulandırın . -70 Santigrat derece altındaki sıcaklıklardaçözüm dondurun .
3
GKD 2 O 1.2 mlNADH geliştirici sulandırın . Tamamen eriyene kadar yavaşça çözelti karıştırılır. Vorteks . Saf dimetilüsfloksid 200 mikrolitre
4
Rekonstitüe NADH standart .
Hazırlama
5
ilehücrelerin yıkayın Örnek mı fosfat tamponlu tuzlu su .
6
bir mikro santrifüj tüpü içine , her bir deney için 5 dakika boyunca 2000 RPM'de çalıştırılmıştır Pelet 2x10 (5) hücreleri.
7
, oda sıcaklığında, kuru buz üzerinde 20 dakika ve 10 dakika - donma ve iki döngü hücreleri çözülme NAD /NADH ekstraksiyon tamponu 400 mikrolitre hücreleri ekstrakte edin. Vortextam olarak 10 saniye için hücrelerin özü çıkarıldı .
8 tam olarak 5 dakika süreyle 14,000 RPM'de , bir mikro santrifüj içinde hücre örnekleri Spin p.
9
NAD transfer /temiz bir tüpe NADH hücreleri .
Deney Protokolü 990 mikrolitre NAD /NADH ekstraksiyon tamponu ileNADH standardın
10
sulandırır 10 mikrolitre . , 0 oluşturmak için iki kopya halinde 96 oyuklu bir plaka içerisine 20 , 40, 60 80, 100 de standart 0 , 2 , 4, 6, 8, seyreltilmiş çözeltinin 10 mikrolitre ekleyin . NAD /NADH ekstraksiyon tampon maddesi , 50 mikrolitre ile son kuyu doldurun.
11
Aktarımekstre hücre numuneleri , 50 mikrolitre kopyalar halinde 96 oyuklu bir plaka içine daha önce olduğu gibi .
12 NADH tespiti için hücre örnekleri hazırlayın p. Eppendorf tüpleri içine ekstre hücre örneklerinin 200 mikro litre koyarak hücre örneklerindenNAD ayrışırlar. Bir sıcaklığı kontrol edilen su banyosu içine tam olarak 30 dakika süreyle 60 santigrat için tüpler ısıtın. Çabuk Tüpler buz üzerine koyarakörnekleri serin. Çökeltileri uzaklaştırmak üzere mikro santrifüjdeörnekleri dönerler. Daha önce olduğu gibi , iki kopya halinde 96 oyuklu bir plaka içerisine aktarınızayrıştırılır numunelerin 50 mikrolitre .
13 NAD bisiklet tampon karışımı , 100 mikrolitre NAD ve bisiklet enzim 2 mikrolitreNAD bisiklet tampon karışımını karıştırın p. NADH standartların ve numunelerin her oyuğuna bu yeni çözeltinin 100 mikrolitre ekleyin .
14 tam olarak 5 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin p. Bu süreç NADH'yeNAD dönüştürmek olacaktır.
15 her kuyuya NADH geliştirici 10 mikrolitre ekleyin
. Plaka 1 saat minimum 4 saat maksimum oda sıcaklığında bekletin.
16plaka okuyun veNADH hesaplamak
.