T - hücreleri , dalak , lenf nodülleri ve boyunaltı bezi dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan elde edilebilir, ancak çevresel kan kültürü amaçlar için T -hücrelerinin en hazır kaynağıdır . Kan örnekleri iyice enfeksiyonlar ve diğer kirleticiler için ekranlı ve dikkatli bir güvenlik kabini altında ele alınır . T - hücrelerinin bağışıklık aşı yanıtları incelemek için toksisite ölçümleri ve dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle, kültüre.
İzolasyon
T - hücreleri, genellikle yoğunluğuna tam kan örneklerinden ayrılır gradyan ayırma , T - hücreleri gibi , eritrosit olarak kırmızı kan hücreleri daha az yoğun ve dolayısıyla santrifüj ile ekstre gibi . Uygun bir nötr tuz çözeltisi, Ficoll isopaque çözeltisi , ardından kan numunesine eklenir. Ficoll isopaque T -hücreleri daha büyük, fakat eritrosit daha düşük bir yoğunluğa sahiptir ve santrifüj sırasında T -hücrelerinin üst kaldırılacak sağlayan, hem de hücreler arasında orta bir tabaka oluşturur. T -hücrelerinin süpernatan çıkarılır , daha fazla santrifüj olan ve küçük bir kısım , hücre canlılığı belirlemek için sayıldı. Hücreler ya deneyler veya ileride kullanılmak üzere dondurularak saklanmış doğrudan kullanılır .
Krioprezervasyon
Krioprezervasyon reaktifler odasında T - hücre bozulmasını önlemek için önceden hazırlanır sıcaklığı. Mümkün değilse , hücreler buz üzerinde tutulur ya da soğuk edilir . Reaktifler , hücre kültür ortamı ve 10-13 oranında insan serum albümini ( HSA) protein , hem de hücre kültür ortamı ve yüzde 10 dimetil sülfoksit (DMSO) oluşmaktadır. DMSO dehidrasyon , pH değişikliklerini en aza indirir , ve elektrolit konsantrasyonu değişikliği dondurma ile ilişkilidir . T - hücreleri, bir cryotube olarak reaktif ihtiva eden hücre kültür ortamı ve HSA içinde tekrar süspanse edilir. Reaktif içeren DMSO yavaşça hücrelere ilave edilir ve yavaşça döndürülmüştür edilir . Hücreler daha sonra tedrici bir sıcaklık düşmesini sağlamak için bir kap ihtiva eden dondurma izopropanol transfer edilir ve depolanır.
Çözülme
ne T - hücreleri eritilir , bir cryotube kaldırılır depolama ve 37 santigrat derecede inkübe edilmiştir. Ikises ulaştı ayrı bir tüpe aktarılmış ve santrifüjlenir kadar sonra, uygun eritme ortamı yavaşça hücrelere ilave edilir . Benzonase bazen ölü T - hücrelerinin topaklanma önlemek için çözülme ortamına ilave edilir. Topak santrifüj hücre kültürü ortamı içinde yanıt ve hücre canlılığı değerlendirilir. T - hücreleri daha sonra ilgili deneyler için kullanmaya hazırsınız .