Uygulayıcılar iki oligonükleotidlerin ya da arzu edilen mutasyonu ihtiva eden kısa DNA dizileri sentezlenir. Sonra damıtılmış su ekleyerek , DNA dizileri , dNTP karışımı çözeltisi ve DNA polimeraz enzimi ile kontrol reaksiyonu hazırlar. Daha sonra, üreticinin talimatlarına uygun olarak , sabit bir astar ya da oligonükleotid konsantrasyonu tutarken , iki-şeritli DNA ( dsDNA) çeşitli konsantrasyonları kullanılarak örnek reaksiyonlar bir dizi hazırlar. Onlar 30 saniye boyunca 203 derece Förnekleri tutmak . DNA segmenti iki numarası içerenörnek de , sıcaklık bisiklet altında bir teknik test nerede kez kısa dönemlerde sıcaklık değişiklikleri . Son olarak, örnekler iki dakika boyunca buz üzerine yerleştirilir.Amplifikasyon ürünleri Protokol
DPN I Sindirim
DPN I sınırlama enzimi belirli bölgelerdeDNA keser. Bu enzim bir mikro litre bir mikro - pipet ya da özel bir aerosol dayanıklı pipet kullanarak , standart mineral yağ kaplama , aşağıda her bir amplifikasyon reaksiyonunda doğrudan ilave edilir . Termal döngü , DNA segmentinin amplifiye etmek için kullanılan bir cihaz, bir sıcak-üstlü montaj zorunda değildir , ancak , bir mineral yağı , sadece katlamalı gereklidir. Reaksiyon yavaşça karıştırılır ve daha sonra bir dakika boyunca bir mikro santrifüj içinde koydu. Bundan sonra , numuneler, bir saat boyunca 98.6 derece F inkübe edilir . XL1 - Blue Supercompetent Hücreleri
dönüştürülmesi Protokol
XL1 - Blue bir tetrasiklin olduğu QuikChange mutagenez kiti ile birlikte - dirençli hücre çizgisi . Bu protokol sırasında , teknisyen daha önce buz üzerinde , -112 derece F tutulduhücreleri , çözülme . Sonra ,DPN I ile tedavi edilen DNA'nın bir mikro litre ekleyin , 45 saniye için 107.6 ° F'ye ısıtın ve iki dakika süreyle buz üzerinde reaksiyon yerleştirin. Bu işlemden sonra , teknisyen ( kazein hidrolizat ve maya ekstresi) 107,6 ° F'ye ısıtılır ve bir saat boyunca inkübe NZY bir hazırlık ekleyin. Preparasyon daha sonra agar jel plakalar üzerinde koyun ve 16 saat boyunca 98.6 derece F arasında kuluçkalanır.