Western Blot Talimatlar

Western blot analizi dokusundan izole edilen özel proteinlerin belirlenmesi için iyi bilinen bir tekniktir. Farklı proteinler önce SDS- poliakrilamid jeli üzerinde şarj ve ağırlıkla ayrıldı ve nitroselüloz zara transfer edilir. Transferden sonra , etiketlenmiş antikorlar, arzu edilen protein ile spesifik olarak bağlanan ve X -ışını film ya da proteinine özel leke ile görüntülenmiştir ile fotoğraflandı. Nihai sonuç , belirlenen proteinin varlığını gösteren koyu renkli bantlar gösterir. Bu makalede, karmaşık protein araştırmalar için nitelikli bir laboratuvarda Western Blot analizi yapmak içintemel metodolojisi üzerinde duruluyor. Bu ayrılan proteinler nitroselüloz zar

Damıtılmış su 1 L 'de transfer tampon maddesi (30 g Tris , 144 g Glycine ve 200 ml metanol ile SDS- poliakrilamid jeli (SDS -PAGE)
ihtiyaç vardır su)
Filtre kağıdı , whatman 3 mm
Laboratuvar sünger
Laboratuvar buzdolabının
Laboratuvar karıştırıcı
Western Blot transferi sanığa
Laboratuvar güç kaynağı Tris tuzlu solüsyon ( TBS ) ( tamponlu
24.2 g Tris baz , 1 İt su içinde 80 g NaCl) ) ( TBS içinde yüzde 5 yağsız süt tozu bloke edici çözelti
Primer antikor solüsyonu
Etiketlenmiş antikor konjügatı çözelti, nitro blue
alkalin fosfataz alt-tabaka çözeltisi Fosfat
1

nitroselüloz membran hazırlayın Nitroselülozik membran proteinleri transfer
Daha Talimatını göster

salin ( PBS )
Gel - görüntüleyici kutu tamponlu
tetrazolyum leke . Zar , iki dakika sonra da transfer tampon maddesi içine yerleştirilmiş ve beş dakika için ıslanmaya bırakılmıştır için damıtılmış su içinde ıslatılmış olmalıdır .
2P /sünger /filtre kağıdı /SDS PAGE oluşan bir transfer sandviç birleştirin nitroselüloz membran /filtre kağıdı /sünger . Sandviç yani membran transfer odasının içine anot yakın ve katodajel daha yakın uzanmaktadır hizalanır .Sandviç batık böylece
3

bölmenin transfer tamponu ekleyin . Laboratuar buzdolabı içindeodasını koyun. Zara jelden protein transferi 4 santigrat derece gerçekleştirilmelidir.
4

zar üzerine jelden proteinleri aktarmak için bir güç kaynağı ayarlayın. Transferinin yönü kırmızı kurşun ile gösterilen anoda doğru olduğunu. Büyük proteinler , bir elektrik akımına yanıt olarak daha hızlı bir şekilde hareket eder ve ilk olarak hareket edecektir. Güç kaynağı transfer oranını kontrol eder. Bir gecede transferi için 30 V ve 40 mAgücünü ayarlamak . Aktarımı tamamlandıktan sonra
5

güç kaynağını ayırın . Güç kaynağı takılı durumdaykentransfer tampon ile temas veyasandviç çıkarmayın .
6.

sandviçmembran çıkarın ve çözümü engelleme iki saat boyunca inkübe . Bloklama çözeltisi olarak proteinler, proteinler mevcut olan membran içine absorbe edecektir. Bu istenilen protein mevcut değildir zara bağlanma herhangi bir antikor önleyecektir.
Antikor
7

kullanılarak primer antikor çözeltisi ile nitroselüloz membran inkübe bağlayıcı bir karıştırıcı . Zar, tamamen , en az bir saat için çözelti içine daldırılmış olmalıdır . Bu, bir gece boyunca inkübe etmek için kabul edilebilir.
8

bağlanmamış antikorların çıkarılması için iyice membran yıkayın. TBS ile dört ayrı 10 dakikalık bir yıkama süresi fazla antikoru ortadan kaldırmak için yeterlidir.
9

karıştırıcıyı kullanarak etiketlenmiş antikor konjügatı çözelti içinde membran inkübe edin. Zar en azından bir saat için kuluçkalanmıştır edilmesi gerekmektedir. Etiketlenmiş antikor, alkalin fosfataz konjugat bağlıdır. Bu tanıyan ve birinci antikora bağlanacaktır enzim -antikor bir karışımıdır. PBS içinde 10 dakika boyunca dört kezmembran durulayın

10
Proteininin
Algılama . Bu etiketlenmiş antikor eşleniğin kalan kaldırır.
11 bandı desenler ortaya çıkıncaya kadar , alkalin fosfataz alt-tabaka çözeltisi içindeki membran inkübe p. Alt-tabaka çözeltisi içindeki boya membran içinde antikor- antijen proteinine bağlanan ve koyu renkli bir bant oluşturacaktır. Süreç acil olabilir ya dabantları görülür öncesine kadar 30 dakika gerekebilir .
12. tamamen selofanmembran sarın vesonuçları görselleştirmek içinjel - kamera üzerinde doğrudan yerleştirin

. Jel - görüntüleyiciWestern Blot membran görüntülenensonuçları fotoğrafını yeteneğine sahiptir .