ilgi her proteinin füzyon yapıları oluşturmak veya hazırlamak göster , bu tür her bir yeşil floresan protein (GFP) , rodamin veya bor dipirometen ( BODIPY ) gibi bir floresan - iletim molekülü ile bağlantılı olması ile .
2P her floresan bileşenin ve absorbans ve emisyon dalga boyları belirlemek genel deneyi. (GFP ölçen deney , örneğin, -> Rhodamine hakkında floresans enerji aktarımı , giriş absorbans dalga boyu GFP en emme ( 488 nm) olmasıdır , ve emisyon dalga boyu olduğu tespit rodamin ( 595 nm) için)
.
3 paylarına ait biyokimyasal özelliklerinin , proteinlerin bağlı olarak, deney için uygun bir tepkime tamponu oluşturma p. A TRIS- tabanlı bir tampon genellikle , kalsiyum klorid ve yüzde 0.05 Tween- 20 de dahil olmak üzere , kullanılır. Belirli konsantrasyonları ve parçaları benzer reaksiyonlar ve koşulları ayrıntılı günlük girişleri arayarak belirlenebilir.
4
reaksiyon tamponu içinde çeşitli konsantrasyonlarda ilgi iki raportör -konjüge proteinler karıştırılmakta ve 50-200 kısım ul kuyu başına . Uygun olduğu takdirde de her bir örnek için bir konjugasyon enzim (örneğin, sortase ) ilave edin. Bir uç nokta deneyi gerçekleştiriliyorsa, zaman belirli bir süre boyunca oda sıcaklığında (veya enzimin optimum sıcaklığı) inkübasyon , ardından 96 çukurlu levha okuyucusu üzerinde okuyun izin verir. Bir kinetik tahlilinin yapılması durumunda , ( aşağıya bakınız ) okumaya doğrudan geçin .
5
takın örnek plaka 96 -plaka okuyucu . Yeni bir deneme sayfası oluşturun veayarlar menüsüne erişmek . Girdidoğru absorbans ( uyarma ) ve emisyon dalga boylarında , daha sonra okunacakuygun kuyuları seçin .
Kinetik deneyi gerçekleştirmek ise, bu kez her gibideneyzaman kurs veokuma aralık dönemini ( set 10 dakika ) .
örneği okumaya başlayın .
Microsoft Excel'in grafik fonksiyonu ( veya Graphpad gibi başka bir grafik programı ) kullanarak verileri analiz .